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第十章高效液相色谱法

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第十章 液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography) 10.1 概 述 10.2高效液相色谱仪 10.3各种色谱法的类型 10.1 概 述 高效液相色谱法是继气相色谱之后,70年代初期发展起来 的一种以液体做流动相的新色谱技术. 高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来 的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅 仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 和实现了自 动化 操作。 高效液相色谱 经典色谱 经典的液相色谱法,流动相在常压下输送,所用的 固定相柱效低,分析周期长。而现代液相色谱法引用了 气相色谱的理论,流动相改为高压输送(最高输送压力 可达4.5?107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填 料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米 塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的 检测器,可对流出物进行连续检测。 因此,高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、 自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现 代液相色谱法。 一、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样,液相色谱分离系统也由两相—— 固定相和流动相组成。 液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相 (或在惰性载体表面涂上一层液膜)、离子交换树脂或 多孔性凝胶;流动相是各种溶剂。 被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据 各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离 子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。 液相色谱分离的实质是样品分子(以下称溶质)与溶剂 (即流动相或洗脱液)以及固定相分子间的作用,作用力的 大小,决定色谱过程的保留行为。 根据分离机制不同,液相色谱可分为:液固吸附色谱、 液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排 阻色谱等类型。 二、液相色谱与气相色谱的比较 ? 液相色谱所用基本概念:保留值、塔板数、塔板高度、分离 度、选择性等与气相色谱一致。 ? 液相色谱所用基本理论:塔板理论与速率方程也与气相色谱 基本一致。 ? 但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动 相,而液体和气体的性质不相同; ? 此外,液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不 同,所以,液相色谱与气相色谱有一定差别,主要有以下几 方面: (1)应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物 质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、 离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应 用受到一定程度的限制,据统计只有大约20%的有机物能 用气相色谱分析; 液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制,它非 常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、 离子型化合物及高聚物的分离分析,大约占有机物的70 ~ 80%。 (2)液相色谱能完成难度较高的分离工作 因为: ①气相色谱的流动相*巧锥栊缘模徊斡敕峙*衡 过程,与样品分子无亲和作用,样品分子只与固定相相 互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样 品分子,为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同 比例的两种或两种以上的液体作流动相,增大分离的选 择性。 ②液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色谱等,作为 分析时选择余地大;而气相色谱并不可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作,较低的温度,一般有利于色谱 分离条件的选择。 (3)由于液体的扩散系数比气体的小105倍,因此,溶质在液 相中的传质速率慢,柱外效应就显得特别重要;而在气相色 谱中,柱外区域扩张可以忽略不计。 (4)液相色谱中制备样品简单,回收样品也比较容易,而且 回收是定量的,适合于大量制备。 液相色谱尚缺乏通用的检测器,仪器比较复杂,价格昂 贵。在实际应用中,这两种色谱技术是互相补充的。 综上所述,高效液相色谱法具有高柱效、高 选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应 用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重 要手段之一,目前在化学、化工、医药、生化、 环保、农业等科学领域获得广泛的应用。 现代液相色谱和经典液相色谱比较没有本质 的区别 不同点: 仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱 有较高的效率 和实现了自化 操作。 10.2高效液相色谱仪 溶剂柜 脱气机 泵 手执控制 器 高压输液系统 自动进样器 柱温箱 高 效 液 相 色 谱 仪 进样系统 分离系统 检测系统 记录系统 检测器 压力表 贮液器 高压泵 梯度淋 洗装置 馏分 收集器 进样器 色谱柱 检测器 高压输液系统,进样系统, 分离系统和检测系统 高压输液系统,进样系统,分离系统和检测系统 10.2.1、高压输液系统 溶剂贮存器: 贮存足够数量、符合要求的流动相。 高压泵: 将溶剂贮存器中的流动 相以高压形式连续不断地送 入液路系统,使样品在色谱 柱中完成分离过程 关于溶剂 ? ? ? ? ? ? ? ? 所用溶剂应为HPLC级,水应为二次超纯水; 所用溶剂应经过过滤。过滤水应使用水相滤膜,过滤 有机相应使用有机相滤膜,不能混用,也不要用错。 每一张滤膜只能用一次,不能重复使用。 如果没有在线脱气机,所用溶剂应经过超声脱气。 水易滋生藻类,避免直接照射,过滤后的水最好使用 不要超过两天。 如果条件允许可向溶剂中加入0.001-0.0001M的叠氮 化钠。 注意溶剂的相容性,避免使用不相容的溶剂。 避免使用强酸、强碱或有机氯等腐蚀性溶剂。 在溶剂瓶中的溶剂过滤头可能会堵塞,必要时小心拿 下用强酸(35%硝酸)浸泡1小时,用水冲洗 溶剂准备:过滤 真空 过滤装置 使用HPLC纯溶剂 防止固体颗粒损伤仪器或 柱头 使用小于 0.5 ? m过 滤膜 . 有机物 Teflon 水 - Nylon 66 脱气 目的:除去流动相中溶解或因混合而产生的 气



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